The role of flotillins and their S-palmitoylation in LPS-induced signaling : PhD thesis

Matveichuk, Orest V.

The role of flotillins and their S-palmitoylation in LPS-induced signaling : PhD thesis

Download

Description
Information

Title: The role of flotillins and their S-palmitoylation in LPS-induced signaling : PhD thesis

Abstract:

Flotylina-1 i flotylina-2 są podbłonowymi białkami, które ulegają N-mirystoilacji i/lub S-palmitoilacji i wiążą się z nanodomenami błony komórkowej, tzw. tratwami. Flotyliny tworzą homo- i hetero-oligomery, a także oddziałują z licznymi białkami. Zatem, flotyliny mogą pełnić rolę białek rusztowaniowych, ułatwiających formowanie kompleksów podbłonowych biorących udział w różnorodnych procesach komórkowych.Głównym celem podjętych badań było ujawnienie roli flotylin i ich S-palmitoilacji w szlakach sygnałowych receptora TLR4 aktywowanego przez bakteryjny lipopolisacharyd (LPS) w makrofagach. TLR4 inicjuje kaskadę prozapalną mającą na celu eliminację bakterii, która jednak może prowadzić do sepsy, co wzbudza zainteresowanie molekularnymi mechanizmami aktywacji TLR4. Uzasadnieniem podjęcia badań były: (1) wyniki naszej analizy spektrometrii mas, która wykazała, że ilość palmitoilowanej flotyliny-1 wzrasta w komórkach Raw264 linii makrofagopodobnej stymulowanych przez LPS, co sugeruje udział tego białka w indukowanych szlakach sygnałowych; (2) dane wskazujące, że flotyliny biorą udział w endocytozie i transporcie komórkowym białek tratw błonowych. Typowym białkiem tratw jest CD14, które wspomaga aktywację receptora TLR4 przez LPS. Założono, że flotyliny mogą wpływać na szlaki sygnałowe indukowane przez LPS ze względu na możliwe oddziaływania z białkiem CD14.Aby zrealizować cele badawcze zastosowano cząstki lentiwirusowe i wprowadzono shRNA swoiste wobec flotiliny-2 do komórek Raw264. Uzyskano kilka klonów komórek ze stabilnie zredukowanym poziomem flotiliny-2, które okazały się także pozbawione flotyliny-1. W komórkach zubożonych we flotyliny odpowiedź na LPS była znacząco osłabiona. Zależny od białka TRIF szlak sygnałowy receptora TLR4 prowadzący do aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF3 był zahamowany, a następująca produkcja chemokiny CCL5/RANTES była zmniejszona. Osłabieniu ulegał również szlak sygnałowy zależny od białka MyD88 prowadzący do aktywacji czynnika transkrypcyjnego NFκB oraz wytwarzania cytokiny TNFα. Ten ostatni efekt był jednak silniej wyrażony w komórkach stymulowanych niskim stężeniem LPS, które wymagają udziału białka CD14. Rzeczywiście, ubytek flotylin: (i) obniżał poziom mRNA CD14; (ii) redukował całkowity poziom CD14; (ii) obniżał ilość CD14 na powierzchni komórek. Nie zaobserwowano takich zmian w odniesieniu do receptora TLR4. Z drugiej strony, wymuszona klasteryzacja CD14 w błonie komórkowej (pierwszy efekt wiązania LPS) indukowała S-palmitoilację flotyliny-1 i flotyliny-2, co wskazuje na wzajemne oddziaływania flotylin i CD14. Nadprodukcja flotilin wraz z 23 członkami rodziny zDHHC ujawniła, że zDHHC5 i zDHHC8 mogą S-palmitoilować flotyliny. Wyciszając Zdhhc5 lub Zdhhc8 stwierdzono, że oba szlaki sygnałowe receptora TLR4 wymagają udziału zDHHC5, z naciskiem na szlak zależny od białka TRIF, co może być związane z udziałem zDHHC5 w S-palmitoilacji flotylin. Podsumowując, uzyskane dane wskazują, że flotyliny modulują komórkowy poziom CD14 i oddziałują (pośrednio) z CD14, wpływając tym samym na intensywność odpowiedzi prozapalnej indukowanej przez LPS. Flotyliny prawdopodobnie biorą udział w endocytozie i recyklingu CD14, a także w transporcie nowo zsyntetyzowanego CD14 do błony komórkowej, przy czym wszystkie te zdarzenia mogą być regulowane przez S-palmitoilację flotylin katalizowaną między innymi przez zDHHC5.Powyższe wyniki uzyskano m.in. dzięki opracowaniu modyfikacji techniki wykrywania palmitoilowanych białek. Polega ona na wzbogaceniu białek znakowanych 17ODYA (analog kwasu palmitynowego) i ich odzyskaniu z kulek sprzęgniętych ze streptawidyną, co umożliwia jednoczesną identyfikację szeregu endogennych i nadprodukowanych palmitoilowanych białek. Technika ta została wykorzystana w badaniach przeprowadzonych we współpracy z Instytutem Genetyki Molekularnej ASCR w Pradze i umożliwiła wykrycie S-palmitoilacji białka adaptorowego leukocytów OPAL1, które może być zlokalizowane w tratwach błonowych.